「這個實驗其實不不難,一共只分為兩步。」
「首先是聚合黴鏈式反應,即PCR擴增反應;第二步是黴切反應。」
張興運介紹道。
第一步,在PCR擴增反應部分,只需要跟著想要的結果,明確各種試劑和樣品的加入量以及擴增條件,按照正常的要求操作即可。
需要注意的是,吸取試劑時,一定要排盡氣泡,由于試劑的加入量都非常小,滴加試劑時,常常出現試劑聚集在槍頭尖端,形成一個小液滴,難以滴下,可以將液滴打到離心管內壁上。
利用其與離心管內壁的吸附作用力,將液滴留在離心管內。
最後,再用無菌超純水補足3滴反應體系後,將離心管蓋蓋好,至于離一t2機中,離心30秒,以使試劑、樣品和水在離心管底部充分混勻。
更有利于PCR反應的順利進行,可以大大增加擴增反應的成功率。
至于黴切反應。
可以在滴加實驗一得到的結果後,再滴加適量BSA,它是一種黴切反應催化劑,能夠使黴切反應進行更徹底。
黴切效果更好︰通常試劑一與BSA的體積比約為1︰2。
「我們在在川貝母的PCR鑒別試驗中,Sma I加入量為0。5斗l,BSA的加入量為1斗。滴加BSA後,黴切反應的體系仍為20斗,所以無菌超純水的加入量要相應減少。黴切反應的條件應設置為30,反應2 h。」張興運說道。
陳浩然還是沉默。
但這種沉默已經代表了一種態度。
不贊同,不拒絕。就靜靜的看著,即便你作死也好,即便你成仙也罷,他都這麼靜靜的看著。
當然,實驗室里面的實驗還在繼續。
「電泳檢測黴切反應完成後所得到的溶液。得到的結果是?」楊光問道。
「含有標準規定的長度在100∼250 bp的兩條DNA條帶,需要用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢視。」終于回答道。
走到這一步,實驗的還在繼續。
但至少楊光並沒有再提出什麼質疑。
鐘醫和楊光還是按照實驗步驟再進行,首先,需要制膠和配制電泳緩沖液,制膠用緩沖液和電泳緩沖液應保持一致,用百分之1的TAE或TBE即可。
「注意,在制膠過程中注意做好防護,切勿燙傷。」鐘醫提醒道。
「假好心。我會出事?」楊光沒氣的說道。
兩人,待膠溶液溫度下降至60℃左右時,滴加少量GelRed,振搖混勻後緩慢傾倒人插好梳子的膠槽中,他們盡量不產生氣泡,以免影響電泳效果。
待膠凝固並冷卻至室溫後。即可將其轉移至電泳槽中,準備電泳。
下一步,兩人依次將樣品、對照藥材、空白對照加入膠孑L中。
楊光特別小心,手十分穩,沒有戳破膠孑L邊緣或戳穿膠孔底部。以免影電泳效果。
「他們現在再加加樣緩沖液,這樣做主要是兩個作用。」
「一方面其密度較大,可使樣品沉積在膠孔底部,避免樣品上浮外溢,保障電泳條帶密集緊湊,防止擴散。」
「另一方面,其中添加染色劑。可以在電泳過程中指示前沿。電泳結束後。可將凝膠置于凝膠成像儀上進行檢視。」
張興運說道。
而楊光這麼一路實驗坐下來,正如張興運在報告之中所寫的那樣。
在與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上,在100∼250 bp應有兩條DNA條帶,空白對照無條帶。
只有一點有點問題。
「為什麼其中有一條條帶中出現彌散的情況?」楊光疑惑的問道。
「出現彌散的原因只可能兩種。」鐘醫想了想回答道︰「一方面可能是制膠所用緩沖液與電泳緩沖液不一致,應保持一致。另一種,可能是電泳緩沖液長期未更換,緩沖鹽濃度變化,或緩沖液被污染,應及時更換緩沖液。」
鐘醫的回答打消了楊光的疑惑。
實驗做到這兒,楊光也明白了,鐘醫沒有撒謊,張興運的報告百分之百真實。
整個實驗的難點就在于黴切反應。
但是兩人都是實驗室的好手,自然不會因為這一點小問題出問題。
「現在華夏有什麼重要是用了分子生物學技術在中藥鑒定方面嗎?我說的是已經有標準的。」楊光問道。
「目前僅有蘄蛇、烏梢蛇的分子生物學鑒別收入我國醫藥中標準,分別采用了PCR和聚合黴鏈式反應-限制性片段長度多態性鑒別方法。還有就是我們剛剛做的川貝了。」鐘醫回答道。
是的,分子生物學技術在中藥鑒定方面的應用方興未艾。
這是一場危機,也是一個機遇。
就如同DNA條形碼方法在中藥材鑒定方面取得較好的效果一樣。
中藥鑒定道阻且長,需要經驗鑒別、分子生物學技術、理化鑒別和顯微技術的共同合作。才能真正實現中藥材和飲片的明確鑒定,才能保障中藥和中醫產業的長足發展。
「我無話可說,我這邊讓你們過了。」楊光擺了擺手說道。
是的,從科學上,從實驗上,從藥理上,楊光都無話可說。
在鐘醫的指導下,楊光的這個研究嚴密到不可思議的一個地步,讓人想要從中早一點什麼錯誤出來都特別的難。
听到楊光這麼說,外面已經傳來了壓抑不住的歡呼聲。
「張興運醫生這也太強了吧。他不是中醫嘛,竟然也能讓楊光啞口無言。」
「廢話,只要道理還是那個道理,那麼掌握真理的人一定不怕什麼的。」
「我們贏了嗎?這一局我們贏了嗎?」
「看來真理還是站在我們這一邊的。」
中醫院的眾人已經按捺不住喜悅了,紛紛的笑了起來,說話的聲音都開始變大了。
這還不是重頭戲。
幾大藥廠那邊也在交頭接耳,像是在商量著什麼,雖然不知道他們小聲在說些什麼。不過從他們眼神中流露出的渴望和饑渴,也能夠看出他們的目的了。
「我們哈市對這個藥志在必得啊。你們不知道,我們一到冬天就容易出現這些狀況,現在有一個藥這麼好……」紀建同說道。
「等等。我們滬市可不會讓啊。」範樂生也連忙打斷了紀建同。
這才開始,藥廠就已經爭了起來。