正所謂牆倒眾人推，鼓破萬人捶。
在織田信長率殘部逃回岐阜城還沒多久，西美濃四人眾為了能確保自己能在上杉將軍家旗下得以本領安堵，就調集了三千余軍勢急襲岐阜城。
由于織田信長先前是傾巢而出，將能美濃一國以及南近江諸郡中可以調動的兵力都集中起來南下，使得岐阜城周邊並沒有多少兵力留守。
再加上織田軍在敗退岐阜城的途中還有不少開小差逃離的，使得岐阜城中眼下僅剩不足五百人的守軍。
織田信長深知自己命不久矣，就打算讓歸蝶帶著自己年幼的子女、家卷盡快逃離岐阜城，以免遭遇不測。
但令織田信長所沒有料到的是，歸蝶當即拒絕了織田信長的提議，反而要求與織田信長同生共死。
不僅如此，織田信長的親信家臣丹羽長秀、金森長近、松井友閑、村井貞勝等人也沒有在此刻拋棄織田信長，各率麾下武士扼守岐阜城的要地，誓死不降。
為了不讓織田彈正忠家一脈徹底絕嗣，織田信長還是令家臣三澤秀次率十名武士護衛匆匆元服的織田信孝以及年幼的織田于次丸、秀姬、鶴姬等子女逃離岐阜城，令其于美濃、越前兩國的境目地帶白山、部子山等群山之中藏匿，在萬不得已的時候退入越前一國。
而這時的安藤守就、不破光治、稻葉一鐵、氏家直元等西美濃諸將為了自己的前程，自然不會對曾經的主君織田信長手下留情，畢竟他們已經先後背叛過齋藤道三、齋藤龍興，如今再背叛一次織田信長也是輕車熟路。
西美濃諸將在率軍包圍了岐阜城後，不待八條政定率軍抵達，就率先對岐阜城發起了攻擊。
織田信長並不打算坐以待斃，反而從守軍之中挑選出驍勇之士，並親率五十名騎馬武士以及一百名足輕主動出城迎擊，趁著西美濃勢在岐阜城外立足未穩之際，直接沖入了西美濃勢的陣地，並來回沖殺，如入無人之境。
安藤守就、稻葉一鐵、不破光治、氏家直元四人深知，若是他們輸掉這一仗，就很難再獲得上杉將軍家重用以及本領安堵的機會，于是就率馬眾加入混戰，向織田軍發起反擊，殊死奮戰。
而織田信長麾下的這些驍勇之士也人人抱定背水一戰的決心，所以打得異常頑強。
兩軍一直從中午苦戰到黃昏，往來沖殺，難分勝負。西美濃勢雖然佔據兵力上的優勢，但始終未能取得決勝的優勢。
不過，此時的織田軍也是強弩之末，丹羽長秀、金森長近、村井貞勝、森蘭丸、服部六兵衛等諸多家臣先後在混戰之中被西美濃勢討取。
織田信長也在戰至力竭後與身邊僅剩的三名騎馬武士退回了岐阜城本丸的大廣間之中，並在近習眾之一的湯淺直宗介錯下切月復自盡，享年三十七歲。
歸蝶在織田信長切月復自盡後不久，用齋藤道三贈予的短刀自刎而亡，在自裁前下令湯淺直宗在岐阜城本丸的大廣間放火，不能讓西美濃諸將獲得織田信長的首級。
在歸蝶香消玉損後，湯淺直宗就趁著西美濃勢尚未攻入本丸之際，在大廣間四處點火，尤其是在織田信長的尸體旁堆上不少易燃之物，生怕西美濃諸將辨識出上織田信長的尸體。
不久後，湯淺直宗、松井友閑等家臣、小姓就在織田信長尸體不遠處先後自刎而亡。
很快，岐阜城本丸的大廣間就陷入一片紅蓮之中，這場大火燒毀的不僅僅是織田信長的尸體，同時也將他天下布武的野望徹底燒盡。
此時的西美濃諸將才率軍攻破二之丸不久，急忙下令麾下軍勢滅火，並尋找織田信長的尸體，以免織田信長趁亂逃出岐阜城。
然而，西美濃勢還是晚了一步。
等西美濃勢將岐阜城本丸大廣間里的大火撲滅，已經無法區分那十幾具焦尸了。
為了泄憤，西美濃諸將就順便對岐阜城的城下町進行濫妨狼藉，並將歷經齋藤道三、齋藤義龍、齋藤龍興、織田信長四人才好不容易經營成美濃一國最繁華的城下町付之一炬。
而後，西美濃諸將覺得此次討取的首級太少，就不約而同地的想到了一個最為卑劣的辦法——殺良冒功。
西美濃諸將為了掩蓋自己對岐阜城城下町濫妨狼藉的罪行，就各率麾下軍勢對城下町的町民舉起了屠刀。
短短三天之中，岐阜城城下町以及周邊村落遇害者甚至達到了四千人以上。
曾擔任齋藤道三、齋藤義龍、齋藤龍興、織田信長佑筆的武井夕庵死里逃生，因其曾接待過出使織田家的八條家家臣的緣故，這才獲得了東海道方面上杉軍軍奉行八條憲繁的庇護，並在之後得以面見總大將八條政定，控訴西美濃諸將于岐阜城周邊所犯下的罪行。
八條政定雖然也派人調查確認了西美濃諸將所犯下的罪行，但鑒于長島願證寺與織田家家臣木下秀吉聯合起來，仍與上杉將軍家處于敵對狀態，不能過早對西美濃諸將進行懲處。
因為織田信長死後，上杉將軍家雖說迅速填補美濃一國的權力空白，將美濃一國兼並。但上杉將軍家只是在形式上制服了美濃一國的國人領主，迫使他們俯首稱臣罷了，上杉將軍家在美濃實際的統治基礎並不穩固。
不過，八條政定倒是派遣擔任次席家老的八條能重以前往京都告捷的名義，將西美濃諸將于岐阜城周邊犯下的罪行一並告知八條景定、上杉氏虎二人，由八條景定與上杉氏虎來下達對西美濃諸將的懲處。
之後，八條政定還派遣石川定光、宇都宮定綱、太田資勝等家中重臣分別率軍進駐岐阜城、關城、革手城等地，以防美濃一國再度出現反復。
山岳崩頹，既覆危亡之運。
將本陣布置在小谷城最外圍丁野丸的上杉氏虎有意勸降淺井長政，並許以美濃半國的領地。
淺井長政並沒有答應，因沒有妻兒在身邊的緣故，他沒有太多的顧忌，反而率一百余名城兵從小谷城本丸沖出，意圖向上杉軍發起最後的反擊。