由于進士晴舍突然切月復自盡後，使得二條御所中突發吵雜、尖叫，讓二條御所外的三好義繼認為是足利義輝打算制造混亂趁機逃出京都，就下令麾下軍勢立即用破城槌撞開了二條御所的大門。
可足利義輝在早年曾接受上泉信綱、冢原卜傳二人的指導，是整個扶桑歷史上武術最為精湛的征夷大將軍，世人稱之為「劍豪將軍」。
在三好軍涌入二條御所之前，足利義輝就已經命奉公眾將自己珍藏的所有太刀一一拔出，並插在地板上。
足利義輝見二條御所的大門被攻破後，立即手持太刀率三十余名奉公眾與突入二條御所中的三好軍展開近戰。
此時的足利義輝宛若戰神一般，太刀鈍了立馬上換一把新的，威風赫赫勇不可擋，見一個斬一個，來兩個斬一雙，他的刀光如同鬼魅般閃爍，三好軍的足輕、武士一個又一個倒在地上。
兩個時辰過後，陳尸在足利義輝身邊的三好軍尸體竟然有幾十具。
然而，失去耐心的三好義繼就令鐵炮隊上前，向著還在揮舞著太刀的足利義輝進行集火射擊。
為了不讓足利義輝被鐵炮的彈丸擊中，奉公眾中的荒川晴宣、荒川輝宗等人就主動站在足利義輝的身前，替他擋住了一輪鐵炮集火射擊。
盡管荒川晴宣、荒川輝宗等人舍命為足利義輝擋鉛彈，可足利義輝還是被鉛彈打穿了左腿，在其余奉公眾的攙扶下退入大廣間中。
而後，三好軍在弓足輕和鐵炮足輕的火力掩護下，大量沖入大廣間中，與奉公眾展開近戰。
由于奉公眾的人數實在過于寡少，進士藤延（進士晴舍之子）、彥部晴直、彥部輝信、杉原晴盛、小笠原稙盛、沼田光長、細川隆是、武田輝信、攝津⻞千代丸（攝津晴門之子）等奉公眾先後被三好軍所討取。
足利義輝也因寡不敵眾，被三好軍用障子壓在身上，用大量長槍 刺，幾乎被扎成篩子而亡。就這樣，一代劍豪將軍魂歸離恨天，享年三十歲。
三好義繼得知足利義輝已經身亡後並不解氣，還下令燒毀二條御所，將足利義輝留在二條御所的家卷盡數處決，一個不留。
于是，足利義輝之母、前關白近衛尚通（近衛前久的祖父）之女慶壽院以及側室小侍從、嫡子足利輝若丸等十余人也一同遇害，僅有一女耀姬被石谷光政趁亂帶出，逃入了上杉家擔任足利將軍家取次、青苧奉行的神余親綱府中，請求神余親綱能夠盡快安排他們進入上杉家的領國之中避難。
畢竟，在眼下這般局勢中，石谷光政只能想到依靠上杉家了。畢竟以三好家的實力還不敢公然與上杉家為敵，只要自己能經若狹、越前兩國進入加賀，那麼安全就能得到保障了。再怎麼說，上杉家也是足利將軍家麾下的強力大名，擔任上杉家家宰的八條景定更是出自足利將軍家的奉公眾之後，總不會把自己與年幼耀姬送給三好家吧？
石谷光政最終賭贏了。
神余親綱本就是府中長尾家的譜代旗本眾出身，而且還被上杉謙信派往京畿負責與朝廷、足利將軍家進行聯絡以及販賣越後特產青苧。他在得知三好義繼率一萬余大軍攻入二條御所後吃驚的下巴都快掉到地上，哪怕是與足利義輝關系極差的家宰八條景定都從未想過要發兵攻殺足利義輝，身為管領代的三好義繼竟然會公然發起下克上，將足利義輝殺害。
隨後，神余親綱就收留了石谷光政和耀姬，並為他們安排逃往上杉領的安全路線。
因三好義繼是在光天化日之下，公然率軍攻殺時任征夷大將軍、武家棟梁的足利義輝，這個消息很快就傳遍了京畿諸國。各地大名在听聞三好義繼那喪心病狂的下克上之舉紛紛表示簡直聞所未聞，難以置信。
等到二條御所被完全燒毀後，三好義繼突然想起足利義輝還有兩個正在出家的弟弟。本著斬草除根、不留後患的原則，他就下令三好三人眾、松永久秀立即將足利義輝的兩個弟弟周暠和覺慶暗殺。
而松永久秀當時正身在大和，與筒井家持續交戰中，只是接受了命令，但沒有真的動手，反而將覺慶軟禁在興福寺中。
至于周暠就沒那麼幸運了，很快就被三好軍暗殺。
不過，朝廷方面反而對于足利義輝的突然死亡並沒有表現出非常的關注，只是在永祿之變發生半個多月後的六月七日例行追贈了足利義輝從一位左大臣的官位（《言繼卿記》）。
只不過自第四代將軍足利義持之後的大部分將軍追贈的均是太政大臣，只有壽命及執政時間不長的五代將軍足利義量、七代將軍足利義勝追贈的是比太政大臣略低的左大臣，此外足利義輝之父——前任將軍足利義晴也是追贈的左大臣。
至于足利義輝與朝廷間的關系如何呢？其實倒是有幾個例子，比如在正親町天皇踐祚時候，足利義輝向朝廷獻上太刀及錢五百疋，只不過朝廷方面覺得太少了（《惟房公記》）。
當時身在近江的流浪將軍足利義輝確實不太富裕，而且還沒有多少大名願意支持他重返京都。
到了弘治四年二月末，朝廷方面宣布改元了。本來改元的相關事項應是朝廷方面和足利將軍家方面會商達成一致後予以實施，只不過這次朝廷找到的是擁有京畿諸國實權的三好長慶，與足利義輝完全沒什麼關系。足利義輝雖然為此表示抗議，仍然使用弘治年號但也無濟于事。
齋藤義龍當時也摻和了一下，通過政所執事尹勢貞孝申請到了治部大輔的官位（《御湯殿上日記》）。本來應該作為武家官位推舉人的征夷大將軍足利義輝再次被晾在了一邊，因當時尹勢貞孝是站在三好長慶一方，與足利義輝則是站在對立面的。
可以說足利義輝與朝廷間的關系不能說佳，不少本該由征夷大將軍出面處理的事項都無法一一參與進去。
值得注意的是，織田信長給後來擁立的征夷大將軍足利義昭的那份著名的《十七條意見書》中的開篇首條第一句就是「光源院殿（即足利義輝）怠慢于參覲內里，最終沒能得到神佛的庇佑」（《信長公記》），也從側面可以反映出足利義輝與朝廷的關系。